单细胞逆转录PCR技术研究不同剂量60Coγ射线照射对人脆性组胺酸基因表达的影响

摘要

目的:研究人脆性组胺酸三联体(fragilehistidinetriad,FHIT)基因在电离辐射损伤和辐射致癌早期过程中的动态变化.方法:以SV40病毒转染的永生化人支气管上皮细胞株BEAS-2B细胞为对象,分为0.5Gy,1Gy,2Gy,4Gy,8Gy,16Gy六个照射剂量组和未照射对照组,分别于照射后24小时、72小时和10天,采用单细胞RT-PCR技术以及PCR产物直接测序法检测FHIT基因的表达情况,采用x2检验的统计学方法分析各剂量组各时间点的FHIT基因突变率的差异.同时与人慢性粒细胞白血病急变株k562细胞与人肝癌细胞株7721细胞中FHIT基因的表达情况进行比较分析.结果:正常BEAS-2B细胞及对照组细胞各时间点均未出现异常FHIT转录本的表达,仅见一条长约638bp的特异条带,经与Genebank数据库进行BLAST比对分析,与人FHITcDNA序列100﹪吻合;7721细胞中检出有异常缺失FHIT转录产物,大小约在200～500bp之间,所占百分比为55﹪;K562细胞中检出有异常缺失FHIT转录产物,所占百分比为66.7﹪;BEAS-2B细胞各剂量照射组照后各时间点均不同程度的检出有异常缺失FHIT转录本的表达,大小约在200～500bp之间,照射后24小时各组突变百分比分别为52.6﹪、66.7﹪、57.9﹪、76.5﹪、64.7﹪和81.3﹪,照射后72小时各组突变百分比分别为17.6﹪、22.2﹪、50.0﹪、47.45﹪、47.1﹪和68.4﹪,照射后10天各组突变百分比分别为21.1﹪、25.0﹪、60.0﹪、57.9﹪、61.1﹪和68.4﹪;突变体经DNA测序证实为外显子缺失性突变,且多数缺失的起止处恰为外显子之间的连接部位,从而导致了不相邻外显子之间的融合;经过x2统计分析,横向比较发现,照后24小时各剂量组间突变率无显著差异(P＞0.05),照后72小时0.5Gy组、1Gy组分别与16Gy组突变率有显著差异(P＜0.05),照后10天0.5Gy组、1Gy组分别与2Gy组、4Gy组、8Gy组、16Gy组的突变率有显著差异(P＜0.05);纵向比较发现,0.5Gy组、1Gy组照后24小时分别与照后72小时、照后10天的突变率有显著差异(P＜0.05),其他剂量组各时间点间突变率无显著差异.结论:FHIT基因确实与多种肿瘤的发生发展密切相关;电离辐射可引起FHIT基因的缺失突变,提示其外显子缺失性突变及损伤修复可能在辐射诱发的细胞恶性转化早期过程中起到一定作用.