差异显示PCR法筛选初生丝羽乌骨鸡腿肌表达序列标签(ESTs)

摘要

本实验采用3个26bp T7(dT11)N为锚定引物和24个26bp的M13-ARPs为随机引物共72个引物组合对丝羽乌骨鸡、山地乌骨鸡、AA肉鸡和尼克蛋鸡4个品种腿肌组织进行DDRT-PCR反应。采用SSCP和基因芯片杂交技术对差异显示cDNA片段真实性进行鉴定,得到6个真实差异表达的cDNA片段,测序得到5个表达序列标签(EST)。通过BLAST检索发现:表达序列标签D1与家鸡的线粒体上细胞色素氧化酶Ⅲ(Gallus gallus cytochrome C oxidase subunit Ⅲ)基因同源;表达序列标签D5与家鸡的肌肉肌酸激酶基因(M-CK)基因同源,M-CK基因位于32号染色体上。对未知功能的ESTs,通过BLAST,电子延伸和电子定位发现得到以下信息:表达序列标签D2与金鱼的假设18K蛋白(hypothetical 18K protein-goldfish mitochondrion)相似性最高;表达序列标签D3拼接的重叠群的正向第一阅读框(frame=+1)编码的蛋白质与家鸡的预测HIPK蛋白相似性最高;表达序列标签D4与重叠群contig 2937正向第三阅读框(frame=+3)编码蛋白与14-3-3e蛋白(epsilon isoform of 14-3-3 protein)序列完全一致,14-3-3e基因定位于家鸡的19号染色体,少部分序列在定位在9号染色体上。分析与表达序列标签同源的已知功能的差异表达基因表明:COXⅢ基因在SK和NK中特异表达,而在NP和AA中未表达,暗示COXⅢ基因的差异表达与初生雏鸡腿肌生长发育中有关。M-CK基因在AA中特异表达,而在其余3种鸡中不表达,推测M-CK基因的差异表达在初生雏鸡腿肌发育和分化中起着重要调控作用。14-3-3e基因在SK中不表达,在其他3种鸡中特异表达,推测14-3-3e基因的差异表达可能在初生雏鸡腿肌组织黑色素的合成或运输中起着重要的调控作用。