SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法检测猪圆环病毒2型

摘要

目的:建立一种高效、简便的实时荧光定量PCR方法,用于猪圆环病毒2型定性及定量的检测.方法:利用PCR技术扩增猪圆环病毒2型ORF2保守区基因107bp片段并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行荧光定量PCR扩增猪圆环病毒2型基因片段并绘制标准曲线,然后以提取的PCV-2、PCV-1、PPV和PRV的DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR反应检测.结果:建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与Ct值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2=0.997,Ct值在11.9和26.9.之间.PCV-2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV-1、PPV和PRV均不能扩出.与常规RT-PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点.用该方法对32份健康猪和32份PMWS可疑猪组织定量检测:健康猪阳性率为44％(14/32),病毒载量均小于104拷贝/uL;PMWS可疑猪阳性率96.8％(31/32),病毒载量均大于105.建立的实时荧光定量PCR方法为PMWS的早期诊断提供研究依据.