中国人群CYP450热点突变基因分型芯片检测方法的建立

摘要

目的：探索适合多位点同步检测的SNP扩增方案和杂交检测条件，建立芯片杂交信号判读的标准。rn 方法：在计算机辅助程序的帮助下设计多重扩增的引物和探针；优化荧光标记引物的多重PCR条件。自行制备氨基化片基并点样制片，隔水密闭杂交，激光共聚焦扫描后判读检测结果。rn 结果：根据CAD设计和实验的结果，将8个PCR反应分为三组多重PCR。扩增条件为：预变性94℃ 5min；35次循环：变性94℃ 30see，退火.59℃ 30sec，延伸72℃40see 延伸72℃5min。在20uL反应体系中，含有dNTP各200μmol/L，基因组DNA 40ng，1×PCR缓冲液和0.5UTaq酶。以SSPE杂交液1：9与多重扩增产物混合可以与探针产生较理想的杂交信号。根据合成的野生/突变型模板及基因组杂交的实验结果，认为野生/突变探针杂交信号比值大于4或小于2.5对分型结果的判断有意义，而当信号值在2.5-4范围内应重新检测分析。rn 结论：通过多片段同步扩增和不同位点平衡杂交的实现，以及提高杂交信号强度，证明该技术在流行病学调查上具有可行性，体现了寡核苷酸芯片对药物代谢酶多态性基因分型的优势。要在寡核苷酸合成和保管、反应体系的一致性、以及质量控制等环节予以严格控制，保证试验的稳定性和准确度。