13.SD大鼠肝细胞、Kupffer分离与培养/共同培养

摘要

目的 建立稳定高效分离SD大鼠肝细胞与Kupffer细胞的实验流程,研究SD大鼠Kupffer细胞与肝实质细胞共同培养时Kupffer细胞对肝实质细胞生长、形态功能的影响,为体外原代培养肝细胞的应用及进行相关研究提供参考数据.方法 以原位二步Ⅳ型胶原灌注法消化SD大鼠的肝脏,低速离心法分离肝实质细胞;Percoll液密度梯度离心法分离肝Kupffer细胞;以6:1比例贴壁共培养肝实质细胞与Kupffer细胞;光镜分别观察单独培养与共同培养情况下肝实质细胞的生存和形态;全自动生化仪检测单独与共同培养情况下培养上清白蛋白和糖水平并进行比较.结果 每只大鼠可分离的肝细胞产量平均为(2.03±0.26)×108,细胞活力为88％～95％,平均(91.7±2.11)％.Kupffer细胞产量平均为(3.19±0.20)×107,纯度为85％～92％,平均(88.5±1.83)％.单独培养组上清白蛋白水平在48h、96h、120h、144h、168h比混合培养组高(P＜0.05).在72h和192h两个培养时点两组白蛋白合成水平无显著差异(P＞0.05);单独培养组上清糖水平在96h、144h、168h高于混合培养组(P＜0.05),其他时点无显著差异.结论 (1)通过本实验研究成功地建立了的以肝下下腔静脉为流入道的Ⅳ型胶原酶二步灌流法分离肝实质细胞以及联合Percoll液密度梯度离心法分离Kupffer细胞的实验室操作程序.该操作程序稳定高效实用.(2)按6:1的比例在体外进行肝实质细胞与Kupffer细胞196小时贴壁共同培养实验,实验结果提示,肝实质细胞和Kupffer细胞在适宜的培养条件下可进行共培养;这两种细胞简单的同步贴壁共培养,肝细胞的生长、白蛋白合成功能和糖代谢会受到影响,提示在共培养体系中,要实现肝实质细胞和Kupffer细胞良好生长和两者功能的协调发挥,尚需进一步建立更适宜的共培养系统.