金属元素标记结合毛细管液相色谱-质谱用于蛋白质N-末端肽的鉴定及相对定量新方法研究

摘要

金属标记由于其高效、稳定的标记效率和多重标记等优势在定量蛋白组学研究中受到越来越多的关注。双功能试剂结合金属标签标记用于蛋白质N——末端肽的鉴定及相对定量方法包括:先通过羟基琥珀酞亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸双功能试剂(DOTA-NHS ester)与N-末端肽的氨基反应，再与铜系金属鳌合形成质量标签，最后用异硫氰酸脂修饰的硅球对酶切后蛋白质内部肽段去除，达到对金属标记的N-末端肽的富集。金属标记不仅使N-末端肽的分子量增加了大于500Da的修饰，并且增加了其疏水性，能够使短序列的N-末端肤在液相中保留及在质谱中鉴定。通过对建立的金属元素标记结合毛细管液相色谱-质谱用于蛋白质N-末端肽的鉴定及相对定量方法的优化和应用，实验结果表明，金属元素能够在蛋白质水平使N一末端肽完全标记，此后经过胰蛋白酶酶切和异硫氰酸脂修饰硅球选择性去除新生成的肽段后，在55℃和75℃温度培养的腾冲嗜热菌中成功地鉴定到157个蛋白质的N-末端肽，其中80个蛋白质具有定量信息。随着培养温度从55℃上升到75℃，7个蛋白质表达量上调，16个蛋白质表达量下调。另外大分子的金属标签能够让短序列的N-末端肽被质谱鉴定，在鉴定的蛋白质中，短序列的N-末端肽占到鉴定的N-末端肽数量的55。这表明所建立的方法可有效解决蛋白质组中短序列N-末端肽无法进行质谱鉴定和定量的问题，为其他物种蛋白质组N-末端肽分析和功能研究提供了一种新的方法。