疏密波诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

摘要

目的：通过疏密波对骨髓间充质干细胞(HSCs)体外抽取、分离、纯化、培养、软骨分化等基础实验，以优化软骨组织工程的种子细胞，增强软骨的自我修复功能，延缓软骨的退行性改变，达到预防与治疗骨性关节炎(OA)的目的，同时，探讨疏密波促进软骨生成的最佳波段组合，并从分子生物学水平阐明疏密波调控HSCs向软骨细胞分化的机制，为疏密波治疗仪应用于临床提供实验依据，也为诱导干细胞定向分化为软骨细胞提供一新思路。rn 方法：①实验于2006-10/2008-03在福建中医学院中西医结合研究院完成。选用4周龄SD大鼠45只，雌雄不限，动物处理方法符合动物伦理学标准。②抽取SD大鼠骨髓液，采用全骨髓贴壁培养法经体外分离、纯化、培养获得SD大鼠HSCs，通过倒置相差显微镜观察其生长情况，研究HSCs的体外生长状况。通过检测HSCs表面标志抗原CD45和CD90表达阳性率，对第3代SD大鼠HSCs(F3 HSCs)进行鉴定。③疏密波发射仪由福州大学生物医学仪器研究所提供。根据干预仪器工作模式的不同，将F3 HSCs分为：A组、B组、C组和D组(空白对照组)；组内根据干预时间的差异分为：A1组(仪器在模式Ⅰ下干预30分钟，1次/日)，A2组(仪器在模式Ⅰ下干预60分钟，1次/日)，B1组(仪器在模式Ⅱ下干预30分钟，1次/日)，B2组(仪器在模式Ⅱ下干预60分钟，1次/日)，C1组(仪器在模式Ⅲ下干预30分钟，1次/日)，C2组(仪器在模式Ⅲ下干预60分钟，1次/日)。诱导14天后，采用RT-PCR、甲苯胺蓝染色和免疫组化等方法，研究疏密波对骨髓间充质干细胞(HSCs)向软骨细胞表型分化过程的影响。rn 结果：①体外培养的HSCs生长状况良好，14d可获得均质性较好的HSCs。F3HSCs CD45和CD90表达阳性率分别为2.14%、99.12%。②疏密波诱导14d后，CbfalmRNA、Sox9mRNA均有表达，C组优于其它各组(P＜0.05)，组内无显著性差异(P＞0.05)；甲苯胺蓝染色可见诱导后细胞胞质和细胞外基质异染；免疫组化可见诱导组呈阳性反应。rn 结论：疏密波能诱导骨髓间充质干细胞体外分化为软骨细胞表型，并分泌软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原，且C组优于其它各组，其主要通过上调CbfalmRNA、Sox9mRNA的表达.进而促进糖胺聚糖和Ⅱ型胶原基质的表达来实现。