ASPCR检测微量HIV-1 K103N耐药突变方法的建立

摘要

目的：建立检测微量HIV-1 K103N耐药突变的等位基因特异扩增实时定量PCR(ASPCR)方法，用于微量K103N耐药突变的检测和分析。rn 方法：首先建立检测K103N耐药突变的ASPCR方法，然后对方法进行验证，最后采用ASPCR方法检测对照样本。构建含K103N突变的质粒作为标准品，然后设计特异性引物用以区分野生型和突变型模板，采用SYBR green法进行实时定量PCR，并绘制标准曲线。分别采用特异性和非特异性引物扩增模板，根据二者Ct(Cycle threshold)值结合相应的标准曲线判断是否存在K103N突变及突变比例。对ASPCR检测K103N突变位点的特异性、敏感性、准确性、重复性等进行验证。rn 结果：特异性和非特异性引物扩增等量野生型模板的Ct值之差(△Ct)可达13.56；当突变比例小于0.1%时仍具有良好的准确性；批内变异系数小于0.7%，批间变异系数小于1.6%；检测灵敏度可达0.01%。检测阴性对照样本的△Ct显著高于临界值，阳性对照样本检测结果均为阳性。rn 结论：ASPCR是一种快速、灵敏、准确的检测HIV-1微量耐药突变的方法，可为临床抗病毒治疗提供理论指导。