使用LC-MS/MS技术研究氢氯噻嗪在人体内的代谢规律及其稳定性实验

摘要

研究目的：氢氯噻嗪为中等强度利尿剂,既能快速减轻体重,又能稀释尿液以掩蔽其它禁用物质的滥用,因此,被世界反兴奋剂机构(WADA)列为利尿剂类禁用物质.纵观WADA近十年的年度检查统计数据发现,氢氯噻嗪阳性率一直高居榜首,占利尿剂阳性率的30％左右.氢氯噻嗪利尿强度中等，国际上包括中国所有兴奋剂检测实验室都有很成熟的检测方法，为什么阳性率还如此之高？为此，比利时根特兴奋剂检测实验室在2009年曾经做过复方制剂D℃spir℃hlor（25mg氢氯噻嗪/25mg螺内酯）的人体受试代谢研究，除药物原形外，还发现了代谢物氯噻嗪和降解产物4-Amino-6-chloro-benzene-1，3-disulphonamid（简称ACB），但因为只收集了5天的尿样，因此对其代谢规律的研究并不完整。根据以往经验，在氢氯噻嗪阳性尿中从未发现螺内酯阳性案例，因此本研究只针对氢氯噻嗪进行人体受试实验，对其整体代谢情况进行深入研究。同时，针对氢氯噻嗪容易分解的特点，研究其最佳贮存条件。rn 研究方法：1.检测方法的建立：尿样经稀释并用醋酸铅水溶液沉淀蛋白质后，上清液用多反应监测模式（MRM）进行检测。色谱柱：XDB Eclipse C18（100mm×2.1mm，3.5μm）；柱温：40℃；流动相为pH3.5的甲酸铵溶液（A）/乙腈（B）梯度洗脱（0-3min，10%B；3.01-7min，90%～90%B），流速0.4ml/min；质谱仪：安捷伦公司生产的6410B LC-MS/MS。2.药物人体受试实验：由1男1女两名年龄在25-30岁的健康志愿者进行人体受试。单次单剂量服用25mg氢氯噻嗪片剂，收取服药前和服药后3天内的所有尿样，及之后12天内的晨尿。将尿样稀释和沉淀蛋白质后，直接进行检测。3.氢氯噻嗪稳定性实验：取5名25-30岁健康人群的空白尿，加入氢氯噻嗪配制成浓度为200ng/ml的阳性尿，分别在室温、冷藏和－20℃冷冻条件下贮存。每隔三天对上述阳性尿进行分析。rn 研究结果：对受试者的尿样进行分析后，氢氯噻嗪原形的检测窗口期从根特实验室的5天延长至7天；代谢物氯噻嗪的检测窗口期也延长了10小时左右；而降解产物ACB的检出时间从5天延长到13天。受试尿中氢氯噻嗪浓度峰值在服药后3～9小时之间，最高浓度在23μg/ml-40μg/ml之间；氯噻嗪浓度峰值在服药后6～12小时之间，最高浓度介于825ng/ml-948ng/ml；ACB浓度峰值在服药后9～36小时之间，最高浓度在940ng/ml-2970ng/ml左右。方法验证数据显示，氢氯噻嗪的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为2.5和10ng/ml，线性范围在10-250ng/ml之间；代谢物氯噻嗪的LOD和LOQ分别为1和4ng/ml，线性范围为4-200ng/ml；ACB的LOD和LOQ分别为5和20ng/ml，线性范围介于20-1000ng/ml之间。三种药物在低、中和高三个浓度级别的日内、日间精密度均小于10%；准确度均在88%～109%之内。阳性尿样的稳定性实验显示，氢氯噻嗪在常温和冷藏条件下不稳定，样品浓度均会随着时间的增加而不断降低，同时ACB的浓度升高；当样品处于冷冻状态时，药物无明显分解现象。rn 研究结论：实验结果显示该方法对检测氢氯噻嗪原形、其代谢物氯噻嗪和降解产物ACB具有前处理简单、灵敏度高、准确可靠和重现性好等特点。与之前的文献相比，上述三个禁用物质的检测窗口期都有不同程度的延长。氢氯噻嗪稳定性实验表明，阳性尿样适于在－20℃条件下冷冻保存。