一种分离正常成年大鼠肝脏祖细胞新方法的研究

摘要

目的:利用正常肝脏探索建立一套肝干/祖细胞的分离、培养、鉴定的新方法。方法:通过四步胶原酶灌注法与密度梯度离心技术相结合，分离正常成年大鼠肝机细胞口通过形态学观察、RT-PCR和免疫细胞化学分析肝祖细胞的形态、表型。结果:采用本课题组建立的四步胶原酶灌注法与密度梯度离心技术相结合，可从正常大鼠肝脏中分离出细胞数为2. 5士0. 5 X105/IOOg的肝祖细胞，肝祖细胞的活率是95%士2%.新鲜分离的大鼠肝祖胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液制成肝祖细胞悬液接种于培养瓶中体外培养。结果显示体外培养的第3天，肝祖细胞可形成松散的克隆，细胞形态上为圆形或卵圆形。在体外30天的培养期间，这些细胞缓慢增殖，并显示出祖细胞的特性。RT-PCR结果显示这群祖细胞不仅表达成熟肝细胞的表面标志ALB, AFP, CK18, CK19, HNF-la, HNF-4a的mRNA,还表达造血干细胞的表面标志Thy-1, CD45的mRNA。免疫细胞化学染色表明这群细胞表达ALB,AFP, CK18, CK19, Thy-1和OV-6。结论:通过简单有效的四步灌流法结合密度梯度离心法所获得的肝祖细胞有良好的增殖能力，能表达千细胞和肝细胞的表面标志，为肝干/祖细胞移植提供了良好的细胞来源。