免疫调节剂、免疫调节剂食品和免疫调节剂饲料

摘要

提供免疫调节剂,在所述免疫调节剂中DNA可经口或皮肤给予,而不是注射给予,或者可以象食品一样每日摄食;或者提供免疫调节剂食品或免疫调节剂饲料。将得自诸如枯草芽胞杆菌、乳酸菌、氨基酸生产菌和大肠杆菌的原核生物细胞的DNA加入到食品或者模制成能够经口、皮肤或粘膜给予的DNA免疫调节剂,或者制成食品、饲料或者诸如此类。

说明书

本发明涉及外用的含有得自原核生物细胞的DNA的免疫调节剂、免疫调节剂食品、免疫调节剂饲料、锭剂和药物。

人们认为适度激活人和动物的免疫活性对抗传染病(包括普通感冒)是重要的，对癌症的初级预防和控制变应性及特应性疾病等也是重要的。已知得自原核生物细胞的DNA具有免疫强化活性，而得自真核细胞的DNA无免疫强化活性。然而，体外脱氧核糖核酸酶处理使DNA的免疫调节活性丧失(S.Yamamoto等，Microbiol.Immunol.，第36卷(9)，983-997，1992)。迄今为止人们认为，因为人类和动物消化液酶含有脱氧核糖核酸酶，所以只有通过其注射给予才能发挥DNA的免疫调节活性。

然而，因为注射给药对所述机体是个损伤，所以不适合反复给药。为了改善免疫强化所必需的物理条件，实践中相当重要的是通过每日像摄食食物一样服食DNA或者与皮肤粘膜接触达到上述目的。

因此本发明的目的是提供免疫调节剂，在该免疫调节剂中DNA不是通过注射给予，而是例如经口或皮肤给予；或者象食物或饲料一样每日摄食。

为了解决上述问题进行广泛研究的结果，本发明人发现，经口或皮肤给予得自例如枯草芽胞杆菌和乳酸菌的原核生物细胞的DNA意外地显现免疫调节活性。该发现导致完成本发明。

即，本发明将提供含有作为活性成份的原核生物细胞源DNA的免疫调节剂、免疫调节剂食品或免疫调节剂饲料。

本发明为人类或动物提供调节所述免疫功能的方法，所述方法通过经口、皮肤或粘膜给予药用有效量的DNA，所述DNA从原核生物细胞提取获得。

最好是所述DNA是通过以下步骤生产的产品：培养原核生物细胞，收获所述细胞，用细菌细胞壁消化酶将所述细胞溶于水中，并向该裂解液加入乙醇以分离DNA产品。所述DNA可以是细菌细胞的DNA提取制品或乙醇或含水乙醇中的细菌细胞的乙醇不溶性组分。以约40％(体积/体积)含水乙醇可以很好获得所述产品。

最好是所述DNA含有至少8个碱基并包含至少一个CpG序列。所述DNA可以是其钠盐。

在本发明中，网状内皮系统被激活。因此，可治疗传染病。

在本发明中，肿瘤生长被抑制。

在本发明中，自身免疫性皮肤病得到治疗。

在本发明中，所述原核生物不必是特殊的细菌。然而，考虑到安全性问题，可提及枯草芽胞杆菌(杆菌属)、乳酸菌(乳杆菌)、氨基酸生产菌、大肠杆菌等。其中特别优选纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)、乳酸杆菌和氨基酸生产菌用于生产食品。作为乳酸菌，可优选干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus del-brueckii)、粪链球菌(Streptococcusfaecalis)、长双歧杆菌(Biphidobacterium longum)等。作为氨基酸生产菌，可优选例如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)、  黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)、嗜氨微杆菌(Microbacterium ammomaphilum)和大肠杆菌。

可以用已知方法从原核生物细胞生产DNA。例如可以在合适培养基中培养谷氨酸棒杆菌。然后离心收获所述细胞，用0.85％生理盐水洗涤，之后将其悬浮于生理盐水或纯水。加入诸如溶菌酶的细菌细胞壁消化酶溶解细胞。向所述溶液逐渐加入已冷的无水乙醇。将不溶于40％(体积/体积)乙醇浓度的DNA缠绕在玻棒上。用60％v/v乙醇、70％v/v乙醇和80％(重量)乙醇依次洗涤所获得的DNA，真空干燥以获得高纯度DNA制品。

所获得的DNA制品本身可以加入到食品、饲料或饮料。也可能的是将所获得的DNA制品与常规用于药物生产的填料、赋形剂等混合，然后将所述混合物根据需要模制成合适形状以提供药物制剂或食品。所述DNA也可以配制成溶液。

所述原核生物DNA的免疫调节活性在化学上是稳定的。如实施例4和实施例5中所述，即使加入到普通饲料，它既不与饲料成份发生反应也不会因加热而失活。这表明，在生产含有该DNA的免疫调节剂食品和免疫调节剂的步骤中，可以随意地进行烹调或加热灭菌处理。如上所述，得自原核生物的DNA的免疫调节活性是稳定的，未观察到随时间而发生退变。因此，其活性在本品贮藏和流通中不会丧失。

在以免疫调节剂的水溶液形式给予DNA的情况下，特别通过超声处理或限制性内切核酸酶处理使其变为低分子，由此使其粘度降低而方便饮用。在超声处理中，例如，将纯水加入所述DNA制品使其浓度为1％，并对其进行超声处理5-10分钟，同时用冰水冷却。已知得自原核生物细胞的DNA分子显示免疫调节活性，因为其碱基序列是特征性的，而且原核生物细胞与真核细胞不同，它含有大量CpG序列(A.M.Krieg等，Nature，第374卷；第546-549页，1995)。因此，在限制性内切核酸酶处理中，并不特别选择限制性内切核酸酶，只要它能切断CpG键。可以用常规内切核酸酶处理方法进行所述限制性内切核酸酶处理。

当将DNA加到食品时，所用食品是不特别受限制的。DNA可以加入到例如主食，诸如面包、面条和大米；配菜，诸如清煮鱼膏(蒲鉾)、火腿、香肠、熟沙拉和醋渍疏菜；调味料，诸如豆瓣酱(日本豆酱)、酱油、汤、沙司和佐料汁；乳制品，诸如奶、可可饮料、奶油、人造奶油、奶酪和冰激淋；糖食，诸如曲奇饼、饼干、薄酥饼、糖果和口香糖；加工果品，诸如果汁饮料和果酱；和宠物饲料、渔业及畜牧业饲料等。

当本发明的DNA作为主要药物应用时，它可以以粉剂、颗粒剂、分散剂、胶囊剂、糖果、饮料或诸如此类口服应用。除此之外，它还可以以软膏剂、敷剂、溶液剂或沐浴制品经皮肤应用以及以锭剂、栓剂或含漱剂经粘膜应用。在经皮肤应用时，优选上述低分子制品。当本发明免疫调节剂通过口服应用时，标准摄入是0.001-100g/天相当量的DNA，而且没有具体的上限。经皮肤使用的DNA浓度范围为0.001-100％，但是它并不特别受限制。

根据本发明，可以提供免疫调节剂，其中的DNA可以经口或皮肤给予，而不是注射给予，或者其中的DNA可以像食物或饲料一样每日摄食；本发明还提供免疫调节剂食品或饲料。

                         实施例

通过给出以下实施例更具体地说明本发明。另外，在实施例中％和份数均是以重量计的。实施例1(细胞DNA的提取)

将谷氨酸棒杆菌IAM 12435接种到含有10ml营养肉汤的L型试管，于30℃振摇培养7小时。分别在10个容量为500ml并含有100mlMimura等的培养基(Hakko Kogaku Zasshi，第41卷，第5期，第275-281页，1963)的锥形瓶中接种1ml所述培养液，于37℃振摇培养21小时。将该培养物再加到20升Mimura等的培养基中，在小型发酵罐中继续培养。然后在对数生长期以0.2单位/ml的浓度加入青霉素G。离心收获所述细胞以获得约1,000g湿细胞。用生理盐水离心洗涤所述湿细胞一次。然后，加入5升生理盐水悬浮所述细胞。一边搅拌一边加入1g卵清溶菌酶。于37℃搅拌2小时后，使温度升至65℃以破坏所述细胞。逐渐加入已经冷却至-20℃的无水乙醇。用玻棒缠绕不溶于40％乙醇浓度的DNA。用60％乙醇、70％乙醇和80％乙醇依次漂洗所获得的DNA，然后真空干燥，获得DNA制品5g。实施例2(DNA的超声处理)

将实施例1中获得的DNA制品以10mg/ml浓度溶解于纯水中。将70ml所述DNA溶液装入超声波仪(Kubota Seisakusho K.K.制造，201M型超声波仪)容器中，并于90kHz超声处理5分钟，同时于-20℃冷却。向该溶液中加入2倍体积-20℃的无水冷乙醇。将所述混合物于-20℃静置24小时。然后将该沉淀离心，真空干燥，获得700mg超声处理的DNA制品。实施例3(DNA的限制性内切核酸酶分解)

将纯水加入到实施例1中制得的DNA制品，使其以10mg/ml浓度溶解。于1ml该混合物中加入100mM tris盐酸缓冲液(pH 7.5)1ml，该缓冲液含有10mM MgCl₂、1mM二硫苏糖醇和100mM NaCl。此外，加入10,000单位限制性内切核酸酶EcoRI(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)，并于37℃进行该反应2小时。加入3M醋酸钠溶液0.2ml，再加入-20℃冷无水乙醇2.5倍体积。该混合物于-20℃静置24小时，然后离心所述沉淀。依次用60％、70％和80％乙醇漂洗所述沉淀，真空干燥，获得限制性内切核酸酶处理的DNA制品8mg。实施例4(用含细菌DNA的饲料或饮用水激活网状内皮系统)

作为一个免疫调节活性指标，检测细菌DNA对网状内皮系统激活的影响。因为以饮用水给予需要降低溶液粘度，所以使用超声处理制品。对一组(5只)6周龄ICR-株雌性小鼠给予含0.1％或1％DNA制品的含DNA饲料或含DNA饮用水。在持续所述给予7天后，以8mg/100g体重静脉给予胶态炭(Pelican Ink)。在注射后0、3、6、9、12和15分钟后，眶后穿刺取血20μl，加到4ml 0.1％碳酸钠中。于675nm波长检测吸光度。用Kato等的方法(I.Kato等，Microbiol.Immunol.，第27卷(7)，611-618，1983)计算碳从血液中清除的半衰期(清除率t1/2)。其结果示于表1。

                            表1

    处理组动物数  t1/2±SDmin      P  给予含0.1％谷氨酸棒杆菌  IAM 12435 DNA的饲料    5    9.0±1.6    ＜0.05  给予含1％谷氨酸棒杆菌    IAM 12435 DNA的饲料    5    4.9±2.0    ＜0.01  给予含0.1％超声处理的谷氨  酸棒杆菌IAM 12435 DNA    的饮用水    5    8.1±2.3    ＜0.05  给予含1％超声处理的谷氨  酸棒杆菌IAM12435 DNA    的饮用水    5    4.1±1.5    ＜0.01  给予含1％纳豆芽孢杆菌    DNA的饲料    5    6.6±0.9    ＜0.01  给予含1％超声处理的纳豆  芽孢杆菌DNA的饮用水    5    5.6±1.1    ＜0.01  给予含1％酵母DNA的饲料    5    12.0±0.7    ns  给予含1％超声处理的酵母    DNA的饮用水    5    11.9±2.2    ns    未处理组    5    13.5±1.8

从表1中的结果可清楚看出的是，在得自所述细菌的DNA中观察到所述网状内皮系统的激活，而在得自真核细胞(酵母)的DNA中未观察到所述网状内皮系统的激活。

按实施例1产生纳豆芽孢杆菌DNA。关于酵母DNA，在YPD培养基(2.0％葡萄糖，1％酵母提取物，2.0％细菌用蛋白胨，pH5.0)中接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FT-1，并于30℃培养。通过用10单位/ml酵解酶Zymolase(Seikagaku Kogyo K.K.生产)的含0.1mM EDTA的Tris盐酸缓冲液pH7.0处理，使所述细胞经受溶菌作用。然后，以2％的速率加入SDS以破坏所述酵母细胞核。此外，按实施例1用冷无水乙醇处理所述产物，以形成酵母DNA制品。

此外，按实施例2生产纳豆芽孢杆菌DNA和酵母DNA的超声处理制品。实施例5(用含细菌DNA的饲料或饮用水抑制肿瘤生长)

得自谷氨酸棒杆菌IAM 12435的DNA(实施例1)用作细菌DNA样品，而实施例4中所述的得自酵母的DNA用作比较和对照。任意给予雌性BALB/c小鼠饲料和水。含每种所述DNA制品(以90℃的产物温度热处理20分钟)的饲料的DNA含量为1％，含每种所述DNA制品(于90℃热处理20分钟)的饮用水的DNA含量为1％。两周后，以1×10⁶细胞在所述小鼠背部皮下植入所述Meth-A肿瘤。此外，持续给予含有所述DNA的饲料。在肿瘤植入后的第十五天，取除所述肿瘤，称其重量。所述结果示于表2。

                        表2

    治疗组  动物    数    瘤重    mg±SE    P  给予含细菌DNA的饲料    19    463±61    ＜0.05  给予含超声处理的细菌    DNA的饮用水    20    349±52    ＜0.05  给予含酵母DNA的饲料    10    650±323    ns  给予含超声处理的酵母    DNA的饲料    10    882±223    ns    未处理组    18    769±80

如下进行所述饲料的生产。即，按照以下配方用常规方法生产混合饲料：20份酪蛋白、10份玉米油、30份矿物质混合物(OrientalYeast Co.，Ltd.生产)、2.0份维生素混合物(Oriental Yeast Co.，Ltd.生产)、49份玉米淀粉、10份糖、5份纤维素和1.0份实施例1中制备的DNA。

从表2可清楚看出的是，给予得自所述原核生物细胞的DNA使所述肿瘤的生长被抑制。实施例6(外用药物的制备)

按照以下配方生产皮肤用制剂。

超声处理的谷氨酸棒杆菌IAM 12435 DNA          1.0％

甘油                                         5.0％

丙二醇                                       4.0％

油醇                                         0.1％

乙醇                                         5.0％

苯甲酸                                       0.05％

纯水                                         84.9％

将超声处理的DNA(实施例2)、甘油和丙二醇加入纯水并溶解。同时，将油醇和苯甲酸溶在室温下溶解于乙醇。将该溶液加到所述纯水部分并溶解。该混合物于90℃加热20分钟，过滤，然后灌装。实施例7(外用药物的制备)

按照以下配方生产皮肤用制剂。

限制性内切核酸酶处理的谷氨酸棒杆菌

IAM 12435 DNA                                1.0％

甘油                                         5.0％

丙二醇                                       4.0％

油醇                                         0.1％

乙醇                                         5.0％

苯甲酸                                         0.05％

纯水                                           84.9％

将限制性内切核酸酶处理的DNA(实施例3)、甘油和丙二醇加入纯水并溶解。同时，将油醇和苯甲酸溶在室温下溶解于乙醇。该溶液加到所述纯水部分并溶解。该混合物过滤，然后灌装。实施例8(锭剂的制备)

按照以下配方生产100片锭剂。

白糖(精制粉)                                    100g

阿拉伯胶(精制粉)                                8g

超声处理的DNA                                   5g

薄荷醇                                          0.6mg

百里酚                                          0.6mg

桉叶油                                          0.002ml

柠檬油                                          0.002ml

水                                              适量

用湿法生产颗粒，并制成锭剂使得一片约1.2g。实施例9

混合实施例1中制得的谷氨酸棒杆菌IAM 12435 DNA粉90mg、淀粉30mg和Avicell(纤维素，Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产)180mg，以常规方法生产片型食品，使得每片为300mg。实施例10

把纯水加入到实施例1中制得的谷氨酸棒杆菌IAM 12435 DNA粉0.05份、可可脂10份、砂糖7份、奶7份和乳化剂0.05份，以将总量调节为100份，用常规方法生产可可饮料。实施例11

把纯水加入到实施例2中制得的谷氨酸棒杆菌IAM 12435 0.2份、可可脂10份、砂糖7份、奶7份和乳化剂0.05份，以将总量调节为100份，用常规方法生产可可饮料。实施例12

用滚筒型制面机生产含DNA的粗制糊剂。该配方为：低强度面粉650g、硬质面粉(精制粗粉)350g、蛋白粉10g、蛋黄粉8g、麦醇溶蛋白15g、乙醇30g、DNA(实施例1)100mg和水280g。实施例13

加入水500g和DNA(实施例1)300mg，蒸煮生大米500g，所述大米已经用水清洗并且已经沥干。

在一组12人中，每人每天食两餐所述配方米饭，持续一个冬季(3个月)，其中仅2人患流感。同时，在未添加DNA的一组(12人)中，8人患者流感。由此，鉴定了DNA的免疫调节活性。实施例14

通过均匀地混合以下组分生产粉状配合饲料：65％白鱼粉39份、大豆饼5份、维生素B1和其它维生素的混合物2份、钙、磷和其它矿物质2份、羧甲基纤维素2份和实施例1中制得的DNA 0.1份。实施例15

已知全身性硬皮病为自身免疫性皮肤病，并认为干扰素对其治疗是有用的。采用用博莱霉素处理的硬皮病小鼠模型，检测实施例6中制得的外用DNA制剂的治疗效应。

每个实验组为6周龄的雌性BALB/c小鼠6只。给两组小鼠的背外侧皮下每天以10μg/0.1ml剂量给予博莱霉素4周。在皮下注射博莱霉素的一组小鼠中局部涂抹所述外用DNA制剂，而皮下注射博莱霉素的另一组局部涂抹作为对照的实施例6中的不含DNA的制剂。从博莱霉素处理开始的5周内每天进行所述涂抹步骤一次。在结束所述涂抹后的当天，测量所述皮肤的厚度。对照组测定值(2倍皮肤厚度±SE(mm))为5.27±0.66，而所述DNA处理组测定值为4.13±0.39。即，在用含DNA制剂处理的组中观察到显著抑制所述硬皮病。