三种致病弧菌感染养殖大黄鱼的分子流行病学研究

摘要

目前已明确引起大黄鱼溃疡病的病原菌主要有溶藻弧菌、哈维弧菌和副溶血弧菌。这些病原菌只有在鱼体中繁殖积累到一定程度时，才开始影响鱼体正常生活，对组织造成损伤从而引起疾病。因此，如何依据疾病的流行病学进行早期病原生物检测，分析病原生物的感染状况及其削长趋势，实现病害的预测预警就显得至关重要。本课题以引起养殖大黄鱼溃疡病的三种致病弧菌为研究对象，开展分子流行病学调查与分析，为养殖大黄鱼疾病的预防与控制起到积极的预警作用。
　　本研究以浙江省象山县黄避岙大黄鱼养殖海区为实验点，选定投喂鱼虾等鲜活饵料的大黄鱼网箱3组，分别为一龄鱼、二龄鱼、三龄鱼；投喂配合饲料的二龄大黄鱼网箱1组。于2012-2013年在定点网箱组各随机采集大黄鱼10尾，每尾实验鱼分别取肝、肾、脾、肌肉等组织提取总 DNA，利用三种弧菌多重 PCR技术进行感染情况的检测与分析。每次采集大黄鱼同时，还跟踪监测了养殖网箱内及海区航道中央水体的理化因子及生物因子。包括水温、盐度、透明度、溶解氧、p H、磷酸盐、硝氮、总氮、总磷、化学耗氧量、TOC、叶绿素a，弧菌总数、粪大肠菌群数等指标。
　　结果显示三种致病弧菌对大黄鱼的感染存在一定的差异性。溶藻弧菌、哈维弧菌对大黄鱼的感染率整体高于副溶血弧菌；从组织上分析，三种弧菌较肝脏、肾脏更易感染肌肉、脾脏；三种弧菌对不同鱼龄的大黄鱼感染率各不相同。研究还表明，三种弧菌在各个采样时间点都有感染，其中7-9月为弧菌感染率高峰期，台风后的感染率较台风前都有一定提高；投喂不同饵料对三种弧菌感染大黄鱼的相关性并不强；弧菌平板分离培养结果与运用多重 PCR技术在检测方面表现出相似的感染趋势，但前者的感染率较后者低。
　　根据大黄鱼三种致病弧菌感染率与环境因子间的相关性分析可知：水温与哈维弧菌及副溶血弧菌感染率表现出极显著相关(P<0.01)，与溶藻弧菌感染率显著相关(P<0.05)；水体中弧菌总数与哈维弧菌的感染率呈极显著的正相关关系，与副溶血弧菌的感染率呈显著相关关系，而其他环境因子与三种弧菌感染率相关性并不强。
　　另外，根据以上2年对大黄鱼溃疡病发生与三种致病弧菌感染率关系的研究可知，在大黄鱼溃疡病大面积爆发前几天，弧菌的感染率都会显示出较高数值。因此可以通过三种致病弧菌对大黄鱼感染的调查与分析来推测病害发生的可能性，尤其当大黄鱼组织检测到较高的弧菌感染率时，应提醒各养殖户积极采取应对措施做好疾病的防控。本研究结果将为养殖大黄鱼溃疡病预测预警模型的构建及有效防控提供实验依据和理论基础。

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引言

1文献综述

1.1大黄鱼病害研究现状

1.1.1细菌性疾病

1.1.2寄生虫性疾病

1.1.3病毒性疾病

1.1.4真菌性疾病

1.1.5其他病害

1.2流行病学研究进展

1.2.1分子流行病学研究

1.2.2鱼类流行病学研究

1.3大黄鱼病害检测技术研究进展

1.3.1传统方法检测与诊断

1.3.2免疫学检测技术

1.3.3分子生物学检测技术

1.4本研究的目的和意义

2大黄鱼三种致病弧菌多重PCR方法的优化及验证

2.1材料与方法

2.1.1菌株来源

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4引物设计

2.1.5 PCR模板的制备

2.1.6多重PCR优化调试

2.1.7多重PCR特异性和灵敏度试验

2.1.8多重PCR的应用检测

2.2结果与分析

2.2.1多重PCR调试优化

2.2.2多重PCR反应的特异性

2.2.3多重PCR灵敏度确定

2.2.4多重PCR的应用检测

2.3讨论

3三种致病弧菌感染大黄鱼的分子流行病学研究

3.1材料与方法

3.1.1主要试剂和仪器

3.1.2实验动物

3.1.3水样采集和处理

3.1.4生物因子的监测

3.1.5理化因子的监测

3.1.6病原菌的分离、纯化及鉴定

3.1.7鱼类总基因组的提取

3.1.8三种致病弧菌多重PCR检测

3.1.9实验数据处理

3.2结果与分析

3.2.1大黄鱼养殖周期与三种致病弧菌之间的感染率关系

3.2.2大黄鱼三种致病弧菌感染率与环境因子间的关系

3.3讨论

3.3.1三种致病弧菌对养殖大黄鱼的感染率分析

3.3.2大黄鱼三种致病弧菌的感染与环境因子的相关性分析

3.3.3三种致病弧菌感染大黄鱼的分子流行病学分析

4本研究主要结论与研究展望

4.1主要结论

4.2创新点

4.3研究展望

参考文献

在学研究成果

致谢