恶性脑胶质瘤TRAIL敏感性相关微小RNA的功能性筛选及靶向协同治疗策略的建立

摘要

第一部分恶性脑胶质瘤TRAIL敏感性相关微小RNA的功能性筛选
　　【背景】恶性胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的脑肿瘤之一，中位生存时间不超过16个月。尽管对于它的治疗已取得很大的进展，但它仍然是最具挑战性的疾病之一。TRAIL（TNF相关的凋亡诱导配体）能够特异性地杀伤肿瘤而不影响正常细胞，因此是很有潜力的抗癌药物。但是已有研究表明，许多肿瘤对其耐受，且在临床试验中，TRAIL因其半衰期短以及体内的不稳定致使其实际应用受到了很大限制。然而，最近的研究表明，使用间充质干细胞（MSCs）表达TRAIL可将TRAIL特异性地运送到肿瘤局部，这可在一定程度上补偿这一缺点。MicroRNA,一类在进化上高度保守的非编码小RNA，可以通过与靶基因的3'非翻译区（UTRs）结合发挥转录后调控作用，进而抑制 mRNA翻译或降解 mRNA。越来越多的证据表明，miRNA在肿瘤细胞的恶性表型的调控中发挥着关键作用，而且已有研究证实，细胞可以外泌体的形式分泌miRNA，进而下调受体细胞中靶基因的表达。因此，这提示联合使用MSCs、microRNA、TRAIL进行肿瘤靶向治疗的策略或许会有很好的治疗前景。
　　【目的】找出可以增敏TRAIL的microRNA，并使用MSCs作为运载工具开展靶向治疗。
　　【方法】为了找到在胶质瘤中可增敏TRAIL的关键microRNA,我们首先对对TRAIL表现不同敏感程度的胶质瘤细胞系进行miRNA表达谱的分析，从中找到与TRAIL诱导的凋亡呈现显著相关性的 miRNAs。之后在不同的细胞中过表达或干涉该microRNA，检测 TRAIL诱导细胞凋亡的情况，进而确认增敏 TRAIL的关键microRNA。然后通过生物信息学预测、双荧光素酶报告基因实验、实时定量PCR和蛋白印迹实验，找到该miRNA的下游靶基因。同时，通过功能缺失和恢复实验，进一步确定这样一条调控轴线。然后对 MSCs进行改造，使其携带 TRAIL和该microRNA，与胶质瘤细胞系U87进行体外共培养实验，验证基因修饰后的MSCs是否可以显著杀伤肿瘤细胞。同时，利用外泌体的抑制剂来进行分析，这种影响是否通过外泌体介导的分子传递来完成的。之后分别通过 transwell实验和免疫组化实验在体外和体内实验中分析，携带TRAIL和microRNA的MSCs是否具有较好的肿瘤趋向性。最后建立裸鼠皮下荷瘤模型，使用TRAIL和microRNA联合过表达的MSCs进行尾静脉治疗实验，确认治疗效果。
　　【结果】发现miR-7在胶质瘤细胞系中的表达情况与TRAIL诱导的细胞凋亡存在显著的正相关关系。之后，功能缺失和恢复实验证实，miR-7确实是胶质瘤细胞系中增敏 TRAIL关键分子。随后，在机制研究中发现，XIAP是其介导该作用的关键的下游靶基因，进一步的研究发现，miR-7-XIAP这种调控关系存在于多种肿瘤中。而且，体内体外实验证实，携带TRAIL和microRNA-7的间充质干细胞具备很好的肿瘤趋向性。同时，通过外泌体抑制实验证实，MSCs可以以外泌体的形式分泌microRNA-7进而下调受体细胞中的 XIAP，从而增强受体细胞的凋亡。最后，更重要的是，在裸鼠移植瘤的治疗模型中，TRAIL和 microRNA-7联合过表达的间充质干细胞表现出很好的促凋亡作用，从而抑制肿瘤的生长，达到较好的治疗效果。
　　【结论】在肿瘤细胞中，miR-7可以通过下调XIAP显著增强TRAIL诱导的细胞凋亡。携带TRAIL和miR-7的MSCs可以特异性地趋向于肿瘤局部，抑制肿瘤的生长。
　　第二部分 microRNA-7在肝癌细胞中的抑癌新机制研究
　　【背景】MicroRNA（miRNA）分子是一类在多细胞生物中广泛转录的、普遍存在的非编码小 RNA分子。成熟的 miRNA分子可通过序列特异性的碱基互补配对结合到mRNA的3’非编码区，形成RNA沉默复合物，进而导致靶 mRNA的翻译抑制或直接将其降解。更重要的是，一个miRNA可以同时调节上百种mRNA，这也使得其能够参与错综复杂的分子调控网络，进而影响细胞的生命活动。越来越多的研究表明，miRNA的正常表达是生命活动正常运转所必需的，而它的失调可能会导致包括肿瘤在内的多种疾病的发生。近来研究发现，在肝癌的发生发展过程中伴随着一些抑癌miRNA的下调，而在这些miRNA中，miR-7在肝癌组织中显著低表达，且miR-7的过表达能够抑制肝癌的增殖和转移。也有研究证实，miR-7可以通过靶向PI3K/AKT通路抑制肝癌的生长和转移。但是，这些都还不能充分揭示 miR-7在肝癌中发挥的关键抑癌作用。
　　【目的】阐明microRNA-7在HCC细胞中的新的抑癌机制。
　　【方法】首先，在肝癌细胞中瞬时转染 miR-7，48小时后使用流式细胞术检测细胞周期。之后，通过生物信息学预测工具分析预测 miR-7的可能下游靶基因，随后通过双荧光素酶报告基因实验初步确认 miR-7的下游靶基因。然后通过实时定量 PCR和Western blot检测 miR-7过表达后的靶基因的 mRNA和蛋白表达水平的变化，同时通过功能缺失和恢复实验进一步确认靶基因与细胞周期的关系。最后在肿瘤临床样品和肿瘤细胞系中分析miR-7与靶基因的RNA表达水平的相关性。
　　【结果】首先发现，在肝癌细胞中过表达miR-7可以显著导致细胞周期G1期阻滞。之后通过生物信息学预测、报告基因实验、实时定量PCR和蛋白印迹实验证实，细胞周期蛋白CCNE1是miR-7发挥该抑制作用的关键下游靶基因。进一步的研究证实，干涉CCNE1与过表达miR-7导致相似的细胞周期变化，同时CCNE1的恢复过表达可以消除miR-7引起的细胞周期G1期阻滞。最后，临床组织样品和细胞系的结果显示，miR-7与CCNE1的表达水平存在着显著的负相关关系。
　　【结论】miR-7可以直接靶向下调细胞周期蛋白 CCNE1的表达，进而导致细胞周期 G1期阻滞，从而抑制肝癌细胞增殖。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

第一部分 TRAIL用于肿瘤治疗的研究现状

第二部分 microRNA-7与肿瘤的研究现状

第一部分 恶性胶质瘤细胞TRAIL敏感性相关的microRNA的筛选、功能鉴定及机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二部分 microRNA-7在肝癌细胞中的抑癌新机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

一、首次发现miR-7是胶质瘤细胞系中致TRAIL敏感的关键分子

二、首次发现miR-7-XIAP调控轴在肿瘤细胞TRAIL敏感性的关键作用

三、间充质干细胞将过表达的miR-7以外泌体的形式传递给肿瘤细胞

四、TRAIL-miR-7共表达的间充质干细胞发挥出较好的治疗效果

五、首次发现miR-7可以导致细胞周期G1期阻滞

六、鉴定出miR-7的新下游靶基因CCNE1

七、MiR-7与CCNE1在肝癌细胞系中和临床样品都呈现出显著的负相关关系

参考文献

个人简历和研究成果

致谢